過去二十年間，隨著對肺癌相關(guān)研究的深入，化療、靶向治療、免疫治療等治療手段不斷推陳出新，肺癌治療水平得到了長足進步。而肺癌患者的精準治療離不開分子生物學(xué)及診斷科技的發(fā)展，液態(tài)活檢作為新興的檢測技術(shù)在肺癌臨床中的應(yīng)用日趨成熟。

日前，在深圳舉辦的“第六屆羅氏診斷全國腫瘤高峰論壇”上，沈陽市肺癌診治中心、沈陽市胸科醫(yī)院腫瘤內(nèi)科主任李茵茵就液態(tài)活檢在肺癌中的臨床應(yīng)用進行了分享，她指出：“液態(tài)活檢已成為組織活檢的有力補充。在部分應(yīng)用場景中，液態(tài)活檢相比組織活檢具有更大的優(yōu)勢，有助于進一步提高肺癌的精準診斷和個體化治療水平。”

從組織活檢到液態(tài)活檢，肺癌精準診斷進階

組織活檢作為腫瘤診斷的“金標準”，在臨床實踐中仍存一定的局限性，包括組織活檢的滯后性、部分患者因自身條件不適合組織活檢、有創(chuàng)的組織活檢可能加速腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險、已發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌癥患者組織取樣可能無法反映患者整體情況等[1]。此外，就肺癌而言，肺癌同一瘤體的不同位置、腫瘤細胞的分化與基因型均存在差異，是一種高度異質(zhì)性的腫瘤[2]。當發(fā)生疾病進展、藥物耐藥或癌細胞轉(zhuǎn)移時，腫瘤細胞的亞克隆不斷變化，異質(zhì)性情況更加多元，組織活檢因而難以完全覆蓋臨床的需求[3,4]。

液態(tài)活檢通過取樣腦脊液、唾液、胸水、血液、腹水、尿液等對疾病進行診斷，能在一定程度上避免組織異質(zhì)性對腫瘤分子分型的影響?；谘旱囊簯B(tài)活檢是目前最主要的研究方向，主要檢測血液中游離的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、循環(huán)腫瘤細胞（CTC）和外泌體（Exosome）。

ctDNA由腫瘤細胞釋放到血液中，往往帶有腫瘤組織的基因突變信息，能夠檢測到包含點突變（SNV）、短片段插入缺失（Indel）、融合基因（Fusion）、拷貝數(shù)變異（CNV）等各類基因突變，可有效覆蓋臨床用藥所需位點的檢測。CTC通常包含更多的信息，如更完整的轉(zhuǎn)錄組、蛋白表達等，但相較于已較為成熟的ctDNA提取和檢測，將CTC從大量血細胞中富集出來并加以檢測的流程更加復(fù)雜。若能獲得存活的CTC，對后續(xù)個體化醫(yī)療動物模型構(gòu)建將有較大幫助[5]。

相較于組織活檢，液態(tài)活檢技術(shù)具有三大明顯優(yōu)勢：一是血檢樣本可及性更高，可以提升很多晚期和復(fù)發(fā)患者的樣本可及性，規(guī)避組織活檢存在的潛在臨床風(fēng)險；二是能夠避免組織樣本異質(zhì)性與取材的風(fēng)險，同一腫瘤的不同位置、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的分子分型都可能存在差異，而組織活檢可能無法對整個腫瘤區(qū)域進行全覆蓋；三是可多次取樣，更易于實現(xiàn)術(shù)后微小殘留病灶（MRD）以及治療效果的動態(tài)監(jiān)控。

分子診斷指導(dǎo)肺癌全程管理，助推精準醫(yī)療發(fā)展

肺癌液態(tài)活檢技術(shù)主要包括數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（dPCR）、實時定量PCR（qPCR）和二代測序（NGS）三種。其中，dPCR通常用于單位點檢測；qPCR用于單基因多位點檢測；NGS則可同時檢測大量基因的不同突變類型。

qPCR是目前最為成熟的液態(tài)活檢技術(shù)，當前主要應(yīng)用于檢測ctDNA中的表皮生長因子受體（EGFR）突變。以新一代cobasEGFR突變檢測（cobasEGFRMutationTestv2）為例，其采用等位基因特異擴增（ASA），利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設(shè)計等位基因特異性PCR擴增引物，只有在引物3’堿基與模板配對時才能出現(xiàn)PCR擴增帶，使ASA引物在野生型DNA上不擴增，減少假陽性率。

一項多中心、開放標簽、隨機化III期研究試驗ENSURE，用于評估厄洛替尼與吉西他濱/順鉑作為EGFR19Del/L858RIIIB/IV期非小細胞肺癌（NSCLC）患者一線治療方案的療效和安全性，研究中的晚期NSCLC患者經(jīng)cobasEGFRMutationTestv2血漿檢出EGFR激活突變，一線使用厄洛替尼治療后，無進展生存期（PFS）比化療有顯著提升[6]。另一項II期、多中心研究AURA2試驗的匯總分析中，晚期NSCLC患者通過cobasEGFRMutationTestv2檢測到血漿T790M陽性，其可以從三代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI）藥物奧希替尼治療中獲益[7]。

cobasEGFRMutationTestv2可識別18-21號外顯子區(qū)域42種基因突變，包括L858R、19號外顯子缺失、L861Q等TKI敏感性突變和包括T790M在內(nèi)的TKI耐藥性突變，是市場上覆蓋點位最多的EGFR檢測，有助于臨床鑒別出更多能從靶向治療獲益的患者。

此外，NGS技術(shù)可獲得ctDNA中各個基因的突變信息，有助于進一步避免腫瘤異質(zhì)性問題，全面分析腫瘤突變情況，同時在用藥監(jiān)測、MRD監(jiān)測、血液腫瘤突變負荷（bTMB）監(jiān)測等方面為臨床提供更多的決策依據(jù)[8]。然而，NGS在實際應(yīng)用中仍存在一些問題：如從每份血樣中提取獲得的游離DNA（cfDNA）都相對較少，樣本量有限；cfDNA中僅有極小的部分是ctDNA，存在背景噪音；不同研究對象之間的腫瘤特異性突變也有所不同；同時NGS文庫制備流程復(fù)雜，各個環(huán)節(jié)的PCR都可能引入潛在的擴增錯誤，從而影響檢測準確性[9]。

羅氏診斷CAPP-Seq深度測序技術(shù)通過在文庫構(gòu)建、數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)的優(yōu)化，引入單分子標簽方案，有效提升了NGS技術(shù)用于檢測ctDNA中EGFR突變的特異性與敏感性。

基于AVENIOSurveillance197panel動態(tài)監(jiān)測肺癌MRD的臨床試驗共入組40例IbIII期局限性肺癌患者，在治療結(jié)束后4個月內(nèi)首次（MRD界標點）進行血漿ctDNA分析，之后每3-6個月動態(tài)監(jiān)測ctDNA水平，結(jié)果表明，ctDNA陽性檢測可早于72%的影像學(xué)診斷的腫瘤復(fù)發(fā)，中位時間提前5.2個月。無論在MRD界標點，還是全隨訪病程，ctDNA陽性患者在PFS及疾病特異生存期均顯著低于ctDNA陰性患者[10]。

在免疫治療領(lǐng)域，POPLAR和OAK研究回顧性分析均顯示，當bTMB≥16時，采用Atezolizumab治療的NSCLC患者臨床獲益顯著優(yōu)于化療，提示bTMB可作為一個獨立預(yù)測生物標志物。

“基于qPCR的液態(tài)活檢技術(shù)最為成熟，經(jīng)過充分論證，已大規(guī)模應(yīng)用于臨床。dPCR的超高靈敏度在血檢中有一定優(yōu)勢，但一次檢測位點較少可能限制其后續(xù)的應(yīng)用場景。而基于NGS的液態(tài)活檢通過動態(tài)監(jiān)測等應(yīng)用場景，有助于患者的全流程管理，后續(xù)有較大潛力，但由于其技術(shù)的復(fù)雜性，其應(yīng)用仍需進一步論證與優(yōu)化。”李茵茵主任總結(jié)道，“未來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進一步發(fā)展革新，液態(tài)活檢的檢測靈敏度和特異性將不斷提高，液態(tài)活檢必將成為腫瘤精準醫(yī)療中的重要一環(huán)。”