血友病是一類X染色體連鎖的隱性遺傳性出血性疾病，主要分為兩大類：血友病A(也稱為甲型血友病)和血友病B(也稱為乙型血友病)，分別因凝血因子VIII(FVIII，F(xiàn)actorVIII)或凝血因子IX(FIX，F(xiàn)actorIX)基因突變導致凝血因子的缺乏而引起。血友病A在男性嬰兒中的發(fā)病率為1/5000，血友病B為1/25000，血友病重癥患者血漿相應凝血因子含量小于正常人的1%，會頻繁發(fā)生自發(fā)性出血，如關節(jié)內出血、軟組織血腫、腹腔出血和腦出血等，最終導致嚴重的關節(jié)病、慢性疼痛，顯著影響患者生活質量與壽命。

　　血友病是十分典型的單基因突變引起的罕見病，該病的一些特點使其成為基因治療的理想模型：(1)FIX表達水平的少量提高即能顯著改善臨床癥狀，據(jù)報告凝血因子水平從1%提高至正常血漿水平的2%以上即可顯著降低重癥患者自發(fā)性出血的發(fā)生率；(2)凝血因子治療的有效范圍寬(正常血漿水平的1-100%均可)，不需對表達水平進行嚴格控制。而因FIX的cDNA長度短(約1.6kb)，便于病毒載體攜帶，所以血友病B的基因治療走的更快。

　　血友病B基因治療發(fā)展史

　　從實驗室到臨床，血友病B的基因療法大概經歷了30多年時間，這期間2個關鍵人物——Katherine.A.High博士和AmitNathwani博士做出了卓越的貢獻，可以說是他們倆你追我趕的研究工作促使血友病的基因治療取得了長足發(fā)展。

　　KatherineA.High，SparksTherapeutics公司的總裁和首席科學家，賓夕法尼亞大學兒科學名譽教授

　　AmitNathwani博士，英國倫敦大學學院血液學教授，凱瑟琳多曼迪(KatharineeDormandy)血友病中心和血栓研究室主任

　　圖1.重要血友病B基因治療臨床研究時間線

　　血友病B基因治療的早期臨床研究

　　早在2000年，Katherine.A.High博士就和她在美國費城兒童醫(yī)院(Children'sHospitalofPhiladelphia)的團隊采用腺相關病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)作為載體，嘗試對重型血友病B患者進行基因治療。當時出于安全性考慮，選擇的靶器官是骨骼肌(如若發(fā)生嚴重不良反應，注射位點處的骨骼肌可被切除從而及時終止研究，以充分保證受試者的安全)。這首次的嘗試發(fā)現(xiàn)骨骼肌能正確且持續(xù)地表達FIX(表達可超過10年)，但是分泌入血液中的FIX蛋白含量始終達不到治療劑量(<1%)，無法有效控制患者的出血癥狀。

　　有了第一次的經驗，第二次嘗試他們把靶器官更改為FIX的原始表達器官——肝臟，這一次的試水也一路跌跌撞撞，治療顯示了一定的療效，但也遭遇了各種各樣的新問題。首先遇到的一個問題是在接受治療的患者精液樣本中檢測到病毒載體的DNA，可能存在潛在的遺傳毒性，隨即研究被叫停。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，檢測到的載體DNA來源于精液而非來自精子，并且載體DNA持續(xù)存在的時間較為短暫，一過性的持續(xù)大約9個月時間，研究被批準繼續(xù)進行。隨后在劑量增加試驗，當病毒劑量增加到最高劑量時遇到第二個大問題，并且該問題對后續(xù)的基因治療研究具有重要的參考意義。研究中，原本高劑量組患者在接受治療2周后顯示出良好的治療效果，血漿FIX水平穩(wěn)定增長至12%左右，患者臨床出血癥狀也得到了有效的控制，但隨后發(fā)現(xiàn)患者轉氨酶開始升高(與肝臟損傷相關)，同時伴隨FIX蛋白水平急劇下降，治療后第5周患者轉氨酶水平達到最高值，第12周時緩慢恢復正常水平，與此同時患者體內FIX水平也降至基線水平，療效喪失。

　　這種FIX水平驟然下降、治療效果不能維持的現(xiàn)象在模型動物上從未發(fā)現(xiàn)過，它的出現(xiàn)相當于給研究人員兜頭澆了一盆冷水，也引起了大家的廣泛關注和研究。根據(jù)后續(xù)的機制研究，人們推測FIX表達減少和肝臟毒性可能由T細胞介導的細胞毒反應引發(fā)。患者在接受治療之前可能已感染過相應野生型的AAV病毒，從而體內有抗AAV的記憶T細胞，當再次接觸治療用AAV時產生大量對治療用病毒特異的CD8+T細胞，導致病毒載體的感染效率降低；此外，當患者的肝細胞被AAV感染后，將病毒的衣殼蛋白遞呈于肝細胞表面，T細胞識別這些抗原后最終可特異性地將被AAV感染的肝細胞清除，從而導致FIX蛋白表達驟減，治療效果不能維持。目前，所有接受AAV基因治療的患者在治療后都會產生對病毒衣殼特異的免疫反應，并產生高滴度的抗體，這一現(xiàn)象限制了同類型AAV基因治療的重復進行。這個過程是基因治療研究中一個很有潛力的研究方向，畢竟治療用的病毒載體和具有復制能力的野生病毒并不相同，這個過程究竟是如何引發(fā)，如何阻斷或抑制這個過程都有待闡明。

　　血友病B基因治療的“突破”

　　上述一系列的意外事件在臨床前的小鼠，大鼠，兔，血友病犬和非人靈長類動物研究中都未曾出現(xiàn)過，再次說明了動物模型并不能完全反應人體試驗情況，即使有了充分的臨床前研究，每次的臨床研究仍然像是駛向星辰大海的一葉扁舟，充滿了各種不確定性，最終的成功似乎需要那么一點點運氣的成分。血友病B基因治療的這一點點的“運氣”在這一路荊棘之后最終降臨了。

　　2009年，另一位風云人物——當時還在圣裘德兒童研究醫(yī)院(St.JudeChildren’sResearchHospital)工作的AmitNathwani博士和同事發(fā)起了一項臨床研究，這項研究首次在臨床上實現(xiàn)了FIX的長期表達。該項研究與KatherineA.High博士的主要區(qū)別在于對AAV載體進行了大幅的改造，采用了FIX密碼子優(yōu)化的、自互補(self-complementary)AAV(scAAV2/8-LP1-hFIXco，LP1為肝臟特異性啟動子)作為載體。相比之前研究采用的載體，scAAV2/8-LP1-hFIXco用雙鏈、互補的DNA代替原本的單鏈DNA，因此AAV感染細胞后無需依賴宿主細胞將單鏈基因組轉變?yōu)橛修D錄活性的雙鏈基因組，大幅增加了感染效率；除此之外還對目的基因FIX進行了密碼子優(yōu)化以增加表達量。目的蛋白FIX的表達水平是劑量依賴的，特別值得注意的是，該研究高劑量組患者也出現(xiàn)了轉氨酶升高的情況，在監(jiān)測到轉氨酶(轉氨酶升高被認為與肝臟損傷或炎癥相關)升高后立即對患者進行了激素治療，采用短期的類固醇——氫化波尼松來減少炎癥反應，最終患者的轉氨酶水平在5天內恢復正常。該研究先期披露的結果顯示，scAAV2/8-LP1-hFIXco增加了患者體內FIX水平，并在4個月內達到穩(wěn)定水平(正常水平的1-6%之間)，治療效果可穩(wěn)定維持6年以上，目前這些患者仍在隨訪中?；颊叩腇IX水平與治療劑量相關，高劑量組(2×1012vg/kg)6名患者的FIX水平均有升高，F(xiàn)IX平均值達到5.1&plusmn;1.7%，患者的出血事件發(fā)生率及相應用藥減少了90%以上。同時，該項研究顯示了血友病B基因治療應用AAV8載體的一些優(yōu)勢，相較之前用的主要載體AAV2，AAV8在的人群中的感染率較低具有更強的嗜肝性。這是一項里程碑式的研究，成功證明AAV作為載體的基因治療能在人體中維持較長時間地相對穩(wěn)定地FIX表達，并實現(xiàn)患者表型由重型到輕型的轉換。

　　血友病B基因治療的“飛躍”

　　High博士發(fā)起的臨床研究中，低劑量組患者雖然沒有達到治療效果，但是同時也沒有出現(xiàn)肝臟損傷的跡象，提示載體的劑量和載體介導的免疫反應關系密切；High博士所在的Spark公司在隨后的研究中把重點放在了降低治療用AAV載體劑量方面，同時結合Nathwani博士研究取得階段性成功的研究經驗，High博士團隊對目的基因FIX進行了優(yōu)化。他們采用FIX高活性變體(FIX-Padua，其FIX的338位堿基從精氨酸變?yōu)榱涟彼幔啾扔谝吧虵IX活性增加5-10倍)作為目的基因，試圖通過增加FIX活性提高基因治療效果。SparkTherapeutics公司在2017年的止血與血栓研究學會(HTRS，HemostasisandThrombosisResearchSociety)科學討論會上對該項研究進展做了報告。參與該項研究的10名重型患者在接受載體治療后(劑量為5x1011vg/kg)，出血事件減少了96%、治療用藥減少了99%，其中9名患者無需再注射FIX制品控制出血。治療12周后患者體內FIX活性水平仍可穩(wěn)定維持在14-81%，平均值為33%，比先前的研究有了大幅的提高。值得注意的是，研究中并未發(fā)現(xiàn)嚴重的安全風險，未見大家普遍關注的FIX抑制物生成且無血栓事件發(fā)生，但有2名患者出現(xiàn)了無癥狀的轉氨酶瞬時升高及FIX活性降低的情況，在接受口服皮質類激素治療后，患者轉氨酶水平回歸正常值，F(xiàn)IX活性維持穩(wěn)定水平，其中1位患者FIX活性最終穩(wěn)定在15%左右，而另一位患者維持在70-80%之間，并維持超過9周的時間。這個治療方案已于2016年7月獲得美國FDA的突破性療法認定，這是血友病B基因治療的又一個爆炸性進展，讓我們看到了血友病B治愈的巨大希望。

　　小結

　　基因治療是最有可能治愈血友病的療法，近些年來血友病B的基因治療領域已取得了非常令人振奮的結果，更有樂觀的估計在未來5年內血友病B的基因療法可能面市，真正走到患者中去。同時，血友病基因治療發(fā)展過程中遇到的這些磕磕絆絆也給我們帶來許多思考和提示：

　　不同臨床研究的結果差別巨大，是什么原因導致有些治療效果可以長期維持而有些不能呢？比如，在High博士取得飛躍性成果的研究之前，Baxalta公司同樣發(fā)起過一項FIX-Padua為目的基因的治療性研究，不過這項研究沒有取得同樣的成功，接受治療的患者體內FIX表達水平增加僅能維持8-10周。到底是什么因素導致了不同試驗之間天差地別的結果呢？

　　1.病毒載體，目前來看可能是試驗成功與否最大的影響因素

　　AAV載體有多種血清型，不同血清型有各自親睞的靶細胞，并且不同血清型AAV在人群中的攜帶程度也不同，這可能影響治療效果；

　　AAV病毒載體的大量生產目前還較為困難，同時AAV病毒載體的空載率等質量因素也可能影響治療效果；

　　AAV病毒載體是否有相應的優(yōu)化。

　　2.目的基因

　　hFIX基因有一系列高凝血活性突變體，利用高活性突變體進行治療可提升目的蛋白的表達量，如采用FIX-Padua做為目的基因；

　　目的基因是否經過密碼子優(yōu)化。

　　3.病毒衣殼免疫

　　如何避免和降低患者中發(fā)生病毒衣殼免疫，目前還沒有明確的方法；

　　對于發(fā)生病毒衣殼免疫的患者，使用皮質類激素的耐受性良好，或可控制衣殼免疫反應。