目的

　　研究CIP2A及c-myc在結(jié)直腸管狀腺癌中的表達及與臨床病理因素的關(guān)系。

　　方法

　　采用RT-PCR法及免疫組織化學(xué)法檢測2014年10月至2015年12月期間經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸腫瘤外科治療的60例結(jié)直腸癌患者的腺癌組織和周圍正常組織中CIP2A及c-myc的表達水平；觀察它們在不同臨床病理因素下的表達差異。

　　結(jié)果

　　CIP2A和c-myc基因在結(jié)直腸腺癌組織中的表達明顯高于正常組織（P<0.05）；CIP2A和c-myc基因在不同年齡、性別、瘤體直徑以及腫瘤位置的結(jié)直腸腺癌患者中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；但在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及局部浸潤和不同臨床分期及組織學(xué)分類中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

　　結(jié)論

　　聯(lián)合檢測CIP2A及c-myc基因表達對預(yù)測結(jié)直腸腺癌的臨床分期及評價預(yù)后具有一定的指導(dǎo)價值。

　　在任何腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，原癌基因的活化和抑癌基因的失活起著重舉足輕重的作用，結(jié)直腸癌的發(fā)生和演變過程也同樣如此。c-myc蛋白表達增強，可以促進細胞惡變，最后導(dǎo)致肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)生[1,2]。蛋白質(zhì)磷酸酶2A癌性抑制因子（CIP2A）蛋白是近年被識別的具有抑制PP2A對c-myc蛋白第62位絲氨酸（S62）脫磷酸化作用的一種癌蛋白，其通過增強c-myc的穩(wěn)定性，抑制體內(nèi)PP2A的抑癌作用，導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤生長。本研究通過檢測60例結(jié)直腸癌患者的CIP2A基因和c-myc基因的表達情況，研究CIP2A和c-myc在結(jié)直腸腺癌中的表達及與患者臨床病理因素的關(guān)系。

　　一、資料與方法

　　1．研究對象：

　　收集2014年10月至2015年12月期間青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸腫瘤外科行結(jié)直腸癌根治術(shù)的60例患者的臨床資料。男36例，女24例，平均年齡57歲。全部病例均由病理科組織學(xué)檢測確診為腺癌，中、高度分化25例，低分化35例。腫瘤分期：Ⅰ、Ⅱ期19例，Ⅲ、Ⅳ期41例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。術(shù)前均未行放療及化療。

　　2．標本取材：

　　選取結(jié)直腸癌組織標本，同時取距癌中心5cm處的正常組織作為正常對照組，所取正常對照組織的斷端組織均未發(fā)現(xiàn)癌細胞。所有標本經(jīng)10%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋和蘇木精-伊紅染色，5μm切片。

　　3．免疫組織化學(xué)（免疫組化）方法：

　　主要試劑為兔抗人CIP2A多克隆抗體，兔抗人c-myc多克隆抗體。SP免疫組化試劑盒和DAB顯色劑，購于南京卓必成生物試劑公司。免疫組化方法為用已知癌旁正常結(jié)直腸組織做陰性對照，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。染色結(jié)果判定標準：CIP2A蛋白以細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒判斷為陽性細胞，c-myc蛋白以胞質(zhì)或胞核有棕黃色顆粒判斷為陽性細胞。按染色強度計分：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；在高倍鏡下（×400倍）對每張切片隨機選取5個高倍鏡視野觀察細胞，每個視野500個細胞，共計2500個，按陽性細胞所占的百分比計分：0分為陰性，1分為陽性細胞<10%，2分為10%~50%，3分為>50%，染色強度與陽性細胞百分比的乘積≥2分為免疫組化陽性（+），否則計為陰性（-）。

　　4．RT-PCR檢測方法：

　　RT-PCR試劑購于南京卓必成生物試劑公司。檢測CRC組織及其對應(yīng)的癌旁正常組織中CIP2AmRNA和c-mycmRNA的轉(zhuǎn)錄水平。RT-PCR方法檢測CIP2AmRNA的轉(zhuǎn)錄水平按照Fast200總RNA極速提取試劑盒說明書步驟。反轉(zhuǎn)錄體系如下：1μg總RNA，2μl5×PrimeScriptTMBuffer，0.5μlPrimeScriptTMRTEnzymeMix，0.5μlOligodTPrimer（50μmol/L），0.5μlRandom6mers（100μmol/L），最終以無RNase酶水將總體積補至10μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15min，85℃反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)5s。按照2×TaqPCRMastermix試劑說明配置PCR反應(yīng)體系，最終以ddH2O將總體積補至25μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共進行30個循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物4℃保存，取PCR擴增產(chǎn)物5μl點樣于20g/L的瓊脂上進行電泳。GeneSnap軟件系統(tǒng)分析擴增條帶，將CIP2A基因與β-actin基因擴增條帶吸光度值得比值記為CIP2A基因的相對表達量，每份標本以CIP2A基因和c-myc基因及內(nèi)參基因各重復(fù)3孔，求出3復(fù)孔檢測循環(huán)閾值（Ct）的平均值，最后用2-△Ct=2-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）作為評價CIP2A基因。同法檢測c-myc的基因相對表達量。

　　5．統(tǒng)計學(xué)方法：

　　采用SPSS18.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料用率表示，計量資料采用&plusmn;s表示，組間比較采用χ2檢驗或t檢驗。

　　二、結(jié)果

　　1．結(jié)直腸腺癌組織中CIP2A基因和c-myc基因的免疫組化檢測結(jié)果：

　　CIP2A基因和c-myc基因在結(jié)直腸腺癌組織中的表達分別為75%和80%，明顯高于正常組織22%和12%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；見圖1和表1。