T細胞急性淋巴細胞白血病治療手段有限，患者治愈率和生存率均不高，我們不免關注起它的發(fā)生發(fā)展。

　　這種白血病長期生存率僅約40%

　　T細胞急性淋巴細胞白血?。═-ALL）是起源于胸腺細胞的惡性腫瘤，占兒童急性淋巴細胞白血病（ALL）的15%，占成人ALL的25%。由于對T-ALL生物化學、分子生物學、細胞分子通路研究較少，目前對T-ALL采用與B細胞急性淋巴細胞白血?。˙-ALL）相同的化療及干細胞移植方案。其中化療是目前治療T-ALL的主要手段，但其毒性較大，特別對復發(fā)的老年患者，治愈率及患者生存率均較低。

　　近年來，B-ALL有靶向治療藥物（絡氨酸肌酶抑制）使本來預后較差的BCR-ABL陽性患者的預后提高，并且熱門的CAR-T免疫治療也給B-ALL帶來了希望。但這些靶向治療和細胞免疫治療都不針對T-ALL，導致T-ALL患者長期生存率只有40%左右。

　　投中高質量雜志，我體會到這些

　　T-ALL的研究進展緩慢，引起我們對T-ALL疾病發(fā)生、發(fā)展機制及可行治療策略探索的愿望，于是有了這篇關于MiR-26b在急性淋巴細胞白血病中的作用機制的文章。此文最終發(fā)表于《Leukemia》雜志（10.March.2017|doi：10.1038/leu.2017.80.影響因子12.104）。

　　文章的發(fā)表經過幾次大修，經歷了回答審稿人問題、補充實驗等過程，整個投稿過程歷時7個月。我們于2016年7月投稿，2016年8月進行第一次大修，3個審稿人共提出30個問題，大部分問題是圍繞科學思維邏輯性提出的，并且很多問題有重疊，好多問題可通過進一步實驗研究做出回答，有些也是我們實驗過程中遇到的，我們都做了認真回復。2017年1月，文章修回，2月時第三審稿人再次提出問題，小修之后，3月被接收。

　　從開始miR-26b研究到文章被《Leukemia》雜志接受的2年多時間里，作為主要研究者，筆者積累了一些心得體會，借此與大家分享。

　　我們發(fā)現：

　　1.二代測序技術已經非常成熟，并且成本不高，大部分研究都可以承受，對二代測序高通量大數據進行深入挖掘是很多科學研究進一步深入的瓶頸，我們的經驗是既要依靠生物信息分析先進的算法縮小有效數據量，又要研究者細致深入的查閱文獻，二者缺一不可。

　　2.要善于應用網絡數據庫，避免走彎路。通過篩選的信息可以進一步應用如Oncomine、GEO、TCGA等數據庫進行驗證，有助于有效假說的提出，可以節(jié)省對生物信息數據驗證的時間及經費。

　　3.臨床數據對科研方向的指導是十分有重要的，科研必須符合并解釋臨床現象才更有意義和說服力，并且為進一步的轉化醫(yī)學研究奠定基礎。

　　4.研究者的相互交流溝通緊密合作是項目完成的重要保證，特別是研究遇到困難的時候，相互交流可以打開思路，換一個角度解釋問題是解決問題好方法。

　　5.完成初稿后不要急于求成，多找一些領域的專家及基層科研人員審閱并修改，可以提高投搞的命中率，避免多次拒稿產生強烈挫敗感以至于文章最終“廉價”處理。

　　6.認真對待審稿人的意見。第一次修稿我們共收到30個問題，逐一分析解答，能補充的實驗盡量完成，審稿人的每個問題都需要充分的重視，因為任何一個小問題都有可能成為拒稿的理由。

　　以上是我們對文章發(fā)表的體會，希望對讀者有一定幫助。對本研究感興趣的讀者可往下看，附有文章的簡要介紹。

　　研究簡介

　　1.模型建立

　　為探索T-ALL疾病發(fā)生、發(fā)展機制及可行的治療策略，我們建立了PTEN基因條件敲除的小鼠T-ALL模型，該基因敲除小鼠克服了傳統(tǒng)基因敲除小鼠的缺陷，為T細胞特異性條件性基因敲除。

　　在無Cre重組酶的干預下，小鼠可以正常生長無臨床癥狀。

　　Pten條件敲除小鼠T-ALL發(fā)病時間為6-7周，中位生存時間是90天，發(fā)病的T-ALL小鼠腫瘤浸入多器官系統(tǒng)，包括胸腺、淋巴結、骨髓、肝脾、結腸和骨骼肌。

　　T-ALL白血病期小鼠瘤細胞占外周血的20%以上。

　　該模型T-ALL細胞表型與人類T-ALL相似，共四種免疫表型：CD4、CD8雙陽、雙陰或單陽。

　　2.研究內容

　　以該模型為基礎通過RNA-sequence技術對比小鼠正常胸腺組織和T-ALL白血病細胞中miRNA表達水平，發(fā)現了一系列表達異常的miRNA。從二代測序結果中篩選有價值的數據是現在大部分研究的重點和難點，因此我們進行了生物信息學分析和生物學水平的雙重驗證。

　　從大量的數據中發(fā)現，miR-26b在小鼠正常胸腺組織和正常人胚胎胸腺組織高表達，而在小鼠T-ALL細胞系和7株T-ALL白血病細胞系中低表達。隨后我們利用定量RQ-PCR檢測29例初診的T-ALL患者骨髓單個核細胞，發(fā)現miR-26b在患者白血病細胞中低表達。

　　這使我們確定了miR-26b研究的必要性，并提出假說：miR-26b在T-ALL中起到抑癌作用。

　　接下來，首先對miR-26b進行功能性研究，我們選擇克隆體內miR-26b全長，利用慢病毒載體包裝感染T-ALL細胞，模擬其體內加工剪切過程，檢測其生物學功能。發(fā)現其可抑制細胞增殖促進細胞凋亡。這一步支持了我們的假說：miR-26b在T-ALL中有抑癌作用。

　　進一步對miR-26b進行機制研究，而研究miRNA作用機制首先要找到其作用的靶基因，于是我們做了生物信息學預測及測序分析，然后進行文獻檢索。RQ-PCR及westernblot驗證發(fā)現，miR-26b對PIK3CD的抑制作用，并影響下游信號通路PI3K/AKT途徑和Notch途徑。

　　大部分針對miRNA研究截至到此已基本完成，而我們希望更深入了解miR-26b機制，進一步探索其上游機制。由于miR-26b來自我們的Pten基因敲除小鼠模型，因此我們利用慢病毒載體過表達PTEN，發(fā)現在PTEN缺失的T-ALL細胞系中miR-26b與PTEN表達成正相關，而在PTEN野生型T-ALL細胞中敲除PTEN后miR-26b表達隨之降低，但miR-26bpromoter區(qū)并無PTEN結合位點，因此我們認為，PTEN并非是直接調控miR-26b的轉錄因子。

　　通過生物信息學預測，我們找到了一系列miR-26b的轉錄因子。其中Ikaros過表達后miR-26b表達水平明顯增高，進一步luciferase實驗和ChIP實驗也支持Ikaros是miR-26b的轉錄因子。文獻檢索發(fā)現，PTEN對Ikaros有一定的作用調控關系。因此我們檢測了PTEN過表達及敲除后Ikaros變化，發(fā)現了Ikaros異常剪接體隨之變化。以上機制研究說明，PTEN通過調控Ikaros調節(jié)miR-26b的表達。

　　從假說提出，到功能和機制驗證，我們共用2年時間完成了miR-26b的整個研究。