艾滋病病毒很狡猾，它們會將自己的遺傳物質整合至CD4+T細胞形成病毒庫，以休眠的狀態(tài)長期存在于患者體內。“永久性治愈”艾滋病需要解決潛伏的HIV。近期，來自于美國天普大學醫(yī)學院的胡文輝教授團隊提出了新的思路：他們利用基因編輯技術成功“剔除”人源化小鼠多個器官中潛伏的HIV。

　　人類與艾滋病已經斗爭了超30年，從最初的絕癥到現在的有效治療，艾滋病正朝著慢性疾病的方向慢慢轉變。但是，科學家們一直未曾放棄“治愈艾滋病”的夢想，他們正在努力研發(fā)能夠治愈或者預防艾滋病的“良方”。

　　3月30日，Cell子刊《MolecularTherapy》在線發(fā)表了一篇題為“InVivoExcisionofHIV-1ProvirusbysaCas9andMultiplexSingle-GuideRNAsinAnimalModels”的文章，揭示了科學家們首次利用“魔剪”技術CRISPR有效剔除人源化小鼠多個器官中潛伏的人類艾滋病病毒。

　　“利用基因編輯治療艾滋病”的研究思路從何而來？該技術如何應對HIV變異問題？它對于艾滋病治療將會產生怎樣的意義？帶著這些疑問，生物探索有幸采訪到這篇文章的最后通訊作者、美國天普大學醫(yī)學院的華人科學家——胡文輝教授。他表示：“這種‘導彈式靶向剔除潛伏病毒’的嘗試給以戰(zhàn)勝艾滋病為終點的科學研究帶來新的方向，它有望為徹底治愈艾滋病帶來希望。”

　　1實現“永久性治愈”？根源在于潛伏的HIV

　　“清除潛伏的HIV”——這是胡文輝教授自2008年在天普大學成立獨立實驗室以來一直試圖克服的難關。他表示：“艾滋病難以治愈的根源正是潛伏于人體內細胞中的艾滋病病毒。”

　　根據世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計數據，全球約有6000萬人感染艾滋病毒，其中2000萬人已死亡。近4000萬感染者，75%集中在15個國家，而中國位列其中。人類免疫缺陷病毒（HIV）入侵人體，主要通過攻擊T淋巴細胞瓦解免疫系統(tǒng)，致使患者免疫功能減弱，增加感染各種疾病或者發(fā)生惡性腫瘤的概率，進而威脅生命。

　　慶幸的是，隨著核苷類逆轉錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、抗逆轉錄病毒藥物的相繼問世，艾滋病不再是無藥可治的絕癥。“但是，轉變成慢性病的艾滋病依然面臨多種問題，包括藥物副作用、神經損害、心血管損傷等等。”胡文輝教授強調，“在雞尾酒療法時代，仍有一半以上的艾滋病患者伴隨有不同程度的神經認知功能障礙，而且輕型神經艾滋?。∟euroAIDS）患者數量正逐年增加。”

　　HIV作為逆轉錄病毒，變異性特別強。同時，它們通過將遺傳物質永久性插入宿主細胞DNA中，形成病毒庫。一般情況下，這些潛伏的病毒處于休眠狀態(tài)，一旦脫離藥物抑制，它們便會重新猖獗。所以，治愈艾滋病必須跨過“潛伏病毒”這一難關。

　　近年來，科學家們提出了多種針對潛伏病毒的方法，包括“先激活后絕殺”（Shockandkill）、敲除病毒（Knockout）、永久性潛伏（Permanentsilencing）等等，他們希望通過實現從有效治療到徹底治愈的轉變，真正造福于患者?，F在，胡文輝教授與同校同事KamelKhalili教授、美國匹茲堡大學楊文彬教授課題組合作，第一次在動物模型上成功證實，利用基因編輯技術多靶點、高效剔除潛伏病毒的可行性。

　　2多篇文章，揭示“導彈式靶向剔除潛伏病毒”之旅

　　當被問及“利用基因編輯治療艾滋病”這一研究思路的由來，胡文輝教授表示：“利用基因編輯技術敲除HIV是解決潛伏病毒的一個重要思路。在我們試圖應用傳統(tǒng)基因打靶技術、ZFN和TALEN基因編輯技術尚未成功之際，張峰團隊開發(fā)出可編輯人類基因組的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，這給我們提供了一個很好的技術選擇。”借助于引導RNA（gRNA）和Cas9核酸酶的完美配合，這一“魔剪”技術能夠精準實現目標基因位點的切割、編輯工作。

　　2014年，胡文輝教授課題組和KamelKhalili教授課題組合作，以實驗室培養(yǎng)的潛伏有HIV病毒的人類細胞系為材料，首次成功利用CRISPR實現潛伏病毒的永久性清除，驗證了最初的構想。這一利用基因編輯技術將艾滋病病毒從人類基因組中剔除的文章在《PNAS》期刊一經發(fā)表，就引起了業(yè)界的廣泛關注。

　　隨后2年多，他們從體外試驗轉向動物試驗，不斷優(yōu)化這一有望徹底治愈艾滋病的治療方案，并先后在《ScientificReport》、《AIDS》、《GeneTherapy》期刊發(fā)表研究成果。

　　這一篇最新發(fā)表在《MolecularTherapy》期刊的文章再一次揭示了有關靶向根治艾滋病的動物試驗的可行性和有效性。

　　首先，胡文輝教授帶領文章一作、博士后尹超然等課題組成員篩選和優(yōu)化了多個靶向剪接的腺相關病毒（AAV）的基因療法，在人類HIV轉基因小鼠成功獲得高效率剔除已經整合的HIV基因組（DNA），且能夠顯著抑制（高達60-95%）多個器官組織中HIV的基因表達（RNA轉錄）。

　　隨后，胡文輝教授課題組與楊文彬教授課題組合作，使用改建的鼠類HIV病毒（EcoHIV）建立艾滋病小鼠急性感染模型。因為人類HIV不能感染鼠類動物，他們將帶有生物發(fā)光報告基因的EcoHIV病毒感染免疫缺陷裸鼠，同時給予HIV多靶點/saCas9的AAV-DJ8（人工合成的AAV血清型，綜合了8種自然AAV的血清型特性），然后用活體動物生物發(fā)光圖像檢測儀（BLI）長時間（19天）監(jiān)測動物全身的EcoHIV動態(tài)變化。他們首次證明多靶點基因編輯的AAV-DJ8基因療法能夠高效剔除鼠類HIV病毒（可達96%），并顯著減輕HIV急性感染。

　　最后，他們在人源化小鼠HIV模型上證明多靶點/saCas9的AAV-DJ8基因療法能有效剔除多個器官組織中的人類HIV潛伏感染病毒。他們用人類HIV活病毒感染人源化BLT小鼠(移植有人骨髓、肝和胸腺組織或細胞的免疫缺陷小鼠，其被艾滋病病毒感染和潛伏的方式與人類一致）建立HIV潛伏感染模型，給予HIV多靶點/saCas9的AAV-DJ8，2-4周后在多個器官組織中檢測到HIV基因組的成功切除。

　　圖示：腺相關病毒基因療法將多靶點基因編輯“魔剪”導入HIV感染小鼠體內準確剔除HIV病毒基因組，進而抑制病毒轉錄和消除病毒復制。

　　3“巧妙應對”HIV變異、脫靶、副作用等問題

　　為什么設計多個靶點？胡文輝教授表示有兩個原因：第一，在HIV轉錄區(qū)和結構區(qū)設計了2-4個sgRNA實現多靶點切除，這有利于顯著增加其剔除效率。第二，艾滋病病毒基因易于突變，應用單靶點基因編輯有可能會出現病毒逃逸現象。他認為：“多個有效靶點同時突變的可能性極小，即便某些個體患者出現突變，我們也可以快速重新設計和構建相關的Cas9基因編輯系統(tǒng)。這正是Cas9基因編輯用于精準醫(yī)學的優(yōu)勢所在。”

　　針對CRISPR系統(tǒng)的脫靶問題，胡文輝教授告訴生物探索，他們早期發(fā)表的全基因組測序研究結果以及其它實驗室的研究結果并沒有發(fā)現脫靶效應。即使萬一單個靶點存在脫靶的可能，但是兩個或者多個脫靶點落在同一個正常功能性基因（僅占人類基因組的1.5%）的可能性微乎其微。

　　胡文輝教授強調，相比于目前的抗逆轉錄病毒藥物，這一基于多靶點基因編輯的基因療法最大的優(yōu)勢之一在于安全。團隊精心篩選的靶點sgRNA都是針對外源性病毒基因的，它們對宿主靶細胞的基因組具有高度特異性，從而確保了在剔除病毒過程中不干擾宿主細胞的存活和功能。他覺得，這種“只殺病毒不殺細胞”的效果至關重要。

　　4未來，還有哪些挑戰(zhàn)？

　　胡文輝教授表示：“目前，基因編輯療法尚不能100％清除動物體內的艾滋病病毒，但能夠顯著降低潛伏病毒量。”談及這一研究成果距離臨床試驗的時間，胡文輝教授坦言，盡管目前最看好的AAV基因療法已經在世界各地進行臨床試用，但用于艾滋病病人還有很多挑戰(zhàn)和未知需要面對和解決：

　　第一，艾滋病治療效果的評估。目前，科學家們只是在活體動物身上取得針對艾滋病的腺相關病毒基因療法的高效病毒剔除結果，相關的治療效果評估研究仍在進行之中，尤其是更接近于HIV病人的靈長類動物艾滋病模型，靶向剔除艾滋病病毒的可行性和有效性亟待測試。

　　第二，基因轉移效率難題。在多細胞、組織和器官水平，治療艾滋病和其它感染性疾病以及遺傳性疾病和癌癥的確切效果都取決于基因轉移效率。

　　第三，潛伏的宿主細胞。目前，國際公認的HIV潛伏細胞包括T細胞、單核/巨噬細胞。而我們已有的腺相關病毒血清型是否足夠轉導所有的潛伏T細胞？另外，包括神經干細胞在內的其他細胞是否是尚未被發(fā)現的潛伏宿主細胞？

　　第四，CRISPR/Cas9技術自身的不斷完善。Cas核酸酶的不斷小型化和多元化？基因編輯的效率優(yōu)化和特異性優(yōu)化？

　　未來，能否找到靶向所有免疫細胞或者HIV潛伏細胞特異的基因療法？是否可以借助納米科技、類病毒顆粒優(yōu)化CRISPR系統(tǒng)？采訪最后，胡文輝教授暢談了很多新想法。他說：“對于基因治療艾滋病等疑難雜癥的應用前景，我很有信心，也充滿期待。下一步，我們將繼續(xù)探索更有效、安全的基因療法和細胞療法。”